ATCC細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)*手冊(cè)
更新時(shí)間:2018-10-19 點(diǎn)擊次數(shù):2080
ATCC細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)*手冊(cè)
細(xì)胞是我們很多基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ),那么細(xì)胞能否被成功復(fù)蘇就尤為重要了。
美國菌種保藏中心, 又稱美國模式菌種收集中心(ATCC),是位于馬里蘭洲洛克菲勒的一家私營的,非贏利性組織。目前它可以提供各種動(dòng)植物細(xì)胞、標(biāo)準(zhǔn)品、菌株達(dá)兩萬多種。以下是來自ATCC的*說明,小凳子搬起來。
01 收到細(xì)胞的注意事項(xiàng)
凍存的ATCC細(xì)胞株和雜交瘤細(xì)胞株在運(yùn)送過程中使用干冰保持低溫。收到凍存細(xì)胞后,可以立即解凍復(fù)蘇,去除二甲基亞砜(DMSO)后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。如果不立即復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞,必須將細(xì)胞凍存管放置于液氮罐存儲(chǔ)。請(qǐng)不要將細(xì)胞存儲(chǔ)在-130℃以上的溫度。如果溫度不夠低,達(dá)不到-130℃,細(xì)胞活力會(huì)迅速下降。
對(duì)于浸沒在液氮中細(xì)胞,在復(fù)蘇時(shí)需要特別留意,如果在存儲(chǔ)過程中凍存管出現(xiàn)泄露,液氮會(huì)緩慢的進(jìn)入其中;這樣在解凍的過程中,液氮的揮發(fā)可能會(huì)導(dǎo)致凍存管爆炸或?qū)龃婀苌w掀起,引起碎片飛濺非常危險(xiǎn)。
安全防護(hù):在從液氮中取凍存管以及解凍的過程中,要始終穿戴防護(hù)服、手套以及面罩。
2 產(chǎn)品說明書和質(zhì)檢報(bào)告(COA)
ATCC每個(gè)細(xì)胞株都有一份產(chǎn)品說明書(product sheet),其中包含細(xì)胞株的信息和詳細(xì)的操作指南。細(xì)胞株的所有詳細(xì)介紹可以在 ATCC 網(wǎng)站找到,產(chǎn)品說明書和COA也可以從ATCC網(wǎng)站下載。
3 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng)
1. 準(zhǔn)備工作
先準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)瓶,及產(chǎn)品說明推薦的相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)基。并在37℃水浴中預(yù)先溫?zé)峒?xì)胞培養(yǎng)基。
2. 37℃水浴
小心取出裝有細(xì)胞的凍存管,保持管蓋擰緊,將凍存管蓋以下的部分置于37℃水浴中并輕微的攪拌以幫助解凍。解凍過程應(yīng)該盡快,大約短于2分鐘或待后一塊小冰晶體剛?cè)诨?,就?yīng)將細(xì)胞凍存管取出水浴。
(注意:一定要快速融化冰晶,避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶,對(duì)細(xì)胞造成損害。所以,要避免水浴鍋內(nèi)凍存管太多,導(dǎo)致溫度不夠)
3. 消毒和無菌
在從水浴中取出的細(xì)胞凍存管表面噴灑70%乙醇配制的消毒劑,用無菌紙巾或紗布試干。之后的操作步驟都應(yīng)該遵循在無菌條件下生物安全柜中嚴(yán)格操作。
注意:隨時(shí)更換吸頭和吸管,避免交叉污染。
4. 離心
小心擰開凍存管的頂部,將管內(nèi)容物用1ml移液槍轉(zhuǎn)移到含9毫升培養(yǎng)基的無菌離心管中。離心5到7分鐘(125×g),小心吸去上清液以去除抗凍劑(二甲基亞砜),避免丟失細(xì)胞沉淀。
注意:對(duì)于多數(shù)細(xì)胞系而言,不需要立即去除凍存液,通??稍趶?fù)蘇后8-24小時(shí)換液進(jìn)行去除(但對(duì)于一些對(duì)凍存液敏感的細(xì)胞,我們就需要先進(jìn)行細(xì)胞離心以除去凍存液)。
5. 重懸
將細(xì)胞沉淀重懸于配好的*培養(yǎng)基中。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器,輕輕搖晃使細(xì)胞均勻的分布。
生長(zhǎng)較慢的細(xì)胞株可重懸于5-8ml培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶。生長(zhǎng)較快的細(xì)胞株可重懸于12-20ml培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移到T75培養(yǎng)瓶。ATCC網(wǎng)站有各個(gè)細(xì)胞株的具體生長(zhǎng)狀況及培養(yǎng)方法記載。
A. 復(fù)蘇過程中應(yīng)避免使用過度堿性的培養(yǎng)液(通常我們的培養(yǎng)液中都含有酚紅作為pH指示劑,因此這里既盡量不要使用因偏堿而變紫的培養(yǎng)液)。建議事先將培養(yǎng)容器中加入培養(yǎng)液,置于培養(yǎng)箱中孵育不少于15min,以使培養(yǎng)液達(dá)到其正常的pH值,然后再加入凍存的細(xì)胞。
B.某些細(xì)胞系在解凍后,當(dāng)過于快速的加入大量新鮮培養(yǎng)基時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)滲透壓休克。此時(shí)應(yīng)使用20°C-37°C下多次、少量、逐步增加(每次1-2ml)新鮮培養(yǎng)液的方法,每隔10-20min添加一次新鮮培養(yǎng)液。
6. 培養(yǎng)
將細(xì)胞培養(yǎng)容器置于細(xì)胞培養(yǎng)箱,在溫度37℃, 二氧化碳濃度5%的培養(yǎng)條件下進(jìn)行孵育。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后應(yīng)在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況。
為了確保細(xì)胞活力、遺傳基因型穩(wěn)定和表型的穩(wěn)定,細(xì)胞株的培養(yǎng)需要保持在對(duì)數(shù)期。這意味著需要定期對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。并且注意在細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期之前,即單層細(xì)胞100%匯合長(zhǎng)滿前或懸浮細(xì)胞達(dá)到其推薦的大細(xì)胞密度之前,要進(jìn)行細(xì)胞傳代。監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和繪制每個(gè)細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線都有助于確定細(xì)胞株的生長(zhǎng)特性。